Mazzello dilahirkan di Rhinebeck, New York dan dibesarkan di Hyde Park, New York, anak lelaki Virginia (née Strong) dan Joseph Mazzello, Jr., yang memiliki studio tarian.[1][2] Beliau mempunyai seorang kakak, Mary, dan seorang adik lelaki, John, yang sama-sama berlakon dalam filem. Bapanya merupakan tiga perempat keturunan Itali dan seperempat keturunan Yahudi Jerman, sementara ibunya keturunan Ireland dan Inggeris.[3] Mazzello bersekolah di sekolah Katolik Our Lady of Lourdes.[4] Beliau merupakan alumni Universiti California Selatan, menyertai Sekolah Seni Sinematik USC pada tahun 2001 setelah menerima surat cadangan dari Steven Spielberg.[5] Mazzello membayar untuk sekolah dengan gajinya dari penampilan kecil di The Lost World: Jurassic Park (1997), hal tersebut dijadikan bahan ketawa saat dan sebagai hadiah kelulusannya dari Spielberg.[6]